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簡化基因組測序2b-RAD

產品介紹

    簡化基因組測序2b-RAD特點


    2b-RAD技術(Wang et al, Nat. Methods, 2012)是指基于IIB型限制性核酸內切酶的簡化基因組測序技術。通過對IIB型內切酶酶切基因組產生的等長tag進行高通量測序,可以大幅降低基因組的復雜度,同時不受有無參考基因組的限制,快速進行全基因組范圍內大規模SNP標記的開發與分型。與傳統的簡化基因組技術RAD-Seq相比,2b- RAD技術獲得的標記數目更多、分型準確率更高,可用于高密度遺傳圖譜構建、QTL定位、全基因組關聯分析、群體進化研究、輔助基因組的組裝、全基因組選擇育種等。


    歐易特色


    ● 不經過片段大小選擇,技術重復度好

    ● 具有極強的靈活性,標簽數目多少可控

    ● 標簽長度一致,PCR時具有一致的擴增效率

    ● 根據每個客戶的研究目標和內容靈活定制研究方案

    ● 共顯性標記之外還可以開發顯性標記

    ● 基于混合泊松分布模型的de novo SNP分型算法iML,有效去除重復序列對分型的干擾


    簡化基因組測序2b-RAD項目流程


    2brad流程


    數據分析內容


    標準數據分析

    ● 數據質控  ● 2b-RAD tag產出統計

    ● 基于iML算法的SNP分型  ·有參:與參考基因組比對 ·無參:個體及群體標簽聚類

    SNP位點注釋(基于參考序列的注釋信息)


    高級數據分析

    ● 遺傳連鎖圖譜構建   ● QTL定位

    ● 群體遺傳結構分析 ● 關聯分析

    ● 群體進化研究 ·群體遺傳多樣性指數計算 ·主成分分析(PCA)·群體遺傳多樣性指數計算 ·主成分分析(PCA)


    推薦測序模式


    ● Hiseq X-Ten, PE150

    ● 4 M reads/1 G基因組大小


    簡化基因組測序2b-RAD樣品要求


    ● DNA總量≥1 μg, OD260/280為1.8-2.0

    ● 請提供每個樣品具體的濃度、體積、提取時間,同時附上電泳檢測膠圖、分光光度計或者Nanodrop儀器檢測數據等

    ● 適用范圍:單倍體或二倍體物種(有無參考基因組皆可)

    ● 群體進化研究:群體或亞群的劃分要非常明確,群體或亞群內個體的選擇要具有代表性

    ● 遺傳圖譜構建:群體類型(F1、F2、DH、RIL等);群體數量不少于100個個體


    常見問題


    ● 1. 2b-RAD技術中所用的是一種什么類型的酶?這種酶有什么特性?如何進行選擇?
    2b-RAD所使用的IIB型限制性核酸內切酶是一類商業化的酶,這種IIB型的酶在基因組上識別特定的堿基序列(一般為5-7堿基),然后在識別位點兩側進行雙鏈酶切,全基因組范圍內切出的標簽片段長度相等(如:內切酶BsaXI切出等長的33 bp片段)。針對有參物種,可通過對基因組進行電子酶切結合預期的標簽數確定合適的酶,對于無參物種則可選用其近緣物種基因組序列進行電子酶切。


    ● 2. 2b-RAD標簽平均測序深度是多少?
    為了保證分型結果的可靠性,特別是雜合位點,2b-RAD標簽平均測序深度都會控制在15X以上。


    ● 3. 如何調整標簽密度?
    2b-RAD技術既可以增加標簽密度,也可以降低標簽密度。
    增大密度:通過電子酶切選用酶切識別位點較多的酶,也可同時使用兩種或兩種以上的IIB型酶進行建庫;
    降低密度:IIB型內切酶酶切后產生的片段為粘性末端,并且粘性末端的堿基是隨機的。

    因此,在對酶切片段連接接頭的過程中,可通過選擇性接頭特異地選擇部分標簽進行連接建庫,以達到降低密度的目的。


    案例展示


    案例一:遺傳圖譜——簡化基因組測序2b-RAD構建水產生物精度最高遺傳圖譜并進行QTL定位

    研究背景:

    受全球氣候變暖的影響,珊瑚表現出對高溫的適應能力。人們一直認為對高溫的生理適應而不是遺傳適應,在珊瑚響應氣候變化方面發揮主導作用。


    研究內容:

    本文以鹿角珊瑚(Acropora millepora)為研究對象,采用簡化基因組測序2b-RAD技術構建其遺傳連鎖圖譜,并成功對耐熱基因進行了定位。證明珊瑚的耐熱性是可遺傳的,而且這種適應是來源于珊瑚群體長期的遺傳變異。

    取樣地點及其溫度變化統計

    取樣地點及其溫度變化統計

    QTL定位結果

    QTL定位結果

    研究結果:
    ● 1. 從較溫暖海域的夏洛特公主灣(Princess Charlott e Bay,PCB)和緯度相差約5°的較寒冷海域的奧費斯島(Orpheus Island,OI)共選取了四個colonies。A、B兩個 colonies取自OI, C、D取自PCB。兩兩互交,共構建了10個雜交系。通過耐熱性能實驗發現:來自較溫暖海域的珊瑚繁殖的后代具有更高的耐熱性。相較于精細胞,卵細胞能更有效地將親本的耐熱性傳給下一代,表明母性遺傳在其中發揮了作用。


    ● 2. 30份珊瑚幼蟲子代樣品(3個重復/雜交系;50-70幼蟲/重復)和親本珊瑚24個片段樣品(6個樣品/colony,包括3個對照3個實驗)用于 RNA-Seq。采用SE50測序,子代每個樣品的測序數據量為1.4-7.1 M reads, 0.24-1.17 M UT Cs(uniquetranscript counts);親本每個樣品測序數據量為1.9-11.6 M r eads, 0.28-1.52 M UT Cs。RNA-Seq數據分析表明:珊瑚蟲的耐熱性可能與氧化還原酶、細胞外基質、跨膜轉運蛋白和線粒體膜成分等相關。


    ● 3. 12份親本樣品(3個重復/colony)及326個F1代個體用于2b-RAD建庫測序。親本平均reads數量為3.8 M,子代平均reads數量為0.4 M。SNP分型后使用JoinMap 4.1構建珊瑚的遺傳連鎖圖譜,包括14個連鎖群,標記1448個,總長1358 cM。


    ● 4. QTL定位到2個受耐熱性強選擇的基因組區域,并結合RNA-Seq數據確定了一個與耐熱性能關聯性較強的候選基因,證實珊瑚的耐熱性是可遺傳的。


    案例二:群體遺傳研究——簡化基因組測序2b-RAD進行刺水蚤群體遺傳結構及遷移模式分析

    研究背景:

    在沒有物理障礙的情況下,從中小跨度空間上研究浮游生物的群體遺傳結構仍然具有挑戰性。浮游生物群體大和高頻基因流的特點使得區分浮游生物地理分化非常困難,尤其是在分子標記少的情況下。

    研究內容:

    本研究以大西洋北部的橈足類浮游生物——刺水蚤(Centropages typicus)為研究對象,采用簡化基因組測序2b-RAD技術研究刺水蚤在大西洋北部的群體遺傳結構,以及刺水蚤沿著西北大西洋大陸架,即從大西洋中部海灣到緬因灣的群體連通性。結果表明,簡化基因組測序2b-RAD技術能夠辨別浮游生物群體間細微的遺傳結構差異,并分析了該海域刺水蚤的遷移模式。

    取樣地點

    取樣地點

    基因流模型

    基因流模型

    群體遺傳結構分析

    群體遺傳結構分析


    研究結果:

    ● 1. 從大西洋北部收集刺水蚤樣品,取樣地點包括位于西北大西洋的MAB(Mid-Atlantic Bight)、SNE(Southern New England Shelf)、GB(Georges Bank)、GoM(Gulf of Maine)和東北大西洋的NS(North Sea)、BB(Bay of Biscay)。共取獲61個刺水蚤樣品,采用IIB型內切酶BsaXI、選擇性接頭5’-NNG-3’構建2b-RAD文庫,測序平臺選用Ion ProtonTM(Life Technologies)。61個個體共獲得88.4 M reads,每個個體平均reads數是787,614。以每個等位基因覆蓋度>5X,且至少在80%的個體中存在為標準,共篩選到675個標記位點用于后續分析。


    ● 2. 兩兩群體比對結果表明,西北大西洋和東北大西洋不同群體之間具有顯著性差異,而西北大西洋四個地區的群體之間沒有明顯的遺傳分化,同樣的情況發生在東北大西洋。


    ● 3. 在群體遺傳分析之前,使用BAYESCAN和ARLEQUIN兩種不同方法分析受選擇的標記。去掉正向選擇的位點,保留認為是中性的、平衡選擇的位點,然后用軟件STRUCTURE分析刺水蚤的群體結構。分析結果表明,西北大西洋和東北大西洋可明顯劃分為3個clusters(K=3)。它們之間不是完全分離的,一些個體擁有混合起源。


    ● 4. 通過軟件MIGRATE-N估算群體間基因流流向,基因流流向評估共有6種模型,即:① Panmictic;②Full;③ Nor th to South;④ South to Nor th;⑤ Adjacent;⑥ Gulf S tream。在6種模型中,Full模型的支持率最高。MAB和SNE的突變擴大群體大?。∕utation-escalated population sizes )稍大于GB和GoM。軟件MIGRATE-N分析得到的遷移速率結果表明,從MAB到SNE,也就是向北的洋流強于向南的洋流。



    案例三:生物分型——2b- RAD用于李斯特菌的分型

    研究背景:

    單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種食源性致病菌,這類菌最常用的分子分型方法之一是多位點序列分型(MultiLocus Sequence Typing,MLST)。MLST 分型方法選用多個管家基因進行序列分析, 由于管家基因具有序列高度保守的特點, 因此該方法在同一血清型內分型的分辨力較差。

    研究內容:

    為了建立一種在食品環境中,簡單、快速和低成本的細菌分型方法,意大利研究人員成功將簡化基因組技術,2b-RAD應用到單核細胞增生李斯特菌的分型,并將該技術與傳統的MLST做了比較,結果表明:2b-RAD技術的菌株分型精確度明顯優于傳統的MLST技術。

    兩種分型方法結果對比1
    兩種分型方法結果對比2
    兩種分型方法結果對比
    研究結果:

    ● 1. 從數據庫下載30個單核細胞增生李斯特菌基因組,使用電腦模擬分別進行了MLST分型和2b-RAD分型,結果顯示后者較前者分類更精細。


    ● 2. 從食物中分離到58株李斯特菌,同時進行MLST分型及2b-RAD建庫測序研究。結果表明2b-RAD可以預測MLST分型結果;在群落結構方面,2b-RAD能比MLST提供更多信息。一些被MLST分型技術認定為相同的菌株,2b-RAD技術可基于李斯特菌非核心基因組部分進行區分。以上結果均表明:相較于MLST技術,2b-RAD技術更適于進行微生物分型研究。


    參考文獻


    1. Dixon GB, Davies SW, Aglyamova GA , et al. CORAL REEFS. Genomic det erminants of coral heat t olerance across latitudes. Science. 348, 1460-1462(2015). (IF:33.611)

    2. Blanco-Bercial L, Bucklin A. New view of population genetics of zooplankton: RAD-seq analysis reveals populationstructure of the Nor th Atlantic planktonic copepod Centropages typicus. Mol Ecol . 25, 1566-1580 (2016).(IF: 6.494)

    3. Pauletto M, Carraro L, Babbucci M, et al. Extending RAD tag analysis to microbial ecology: a comparison between MultiLocus Sequence Typing and 2b-RAD t o investigate Listeria monocytogenes genetic struct ure. Mol Ecol Resour .16, 823-835 (2016). (IF: 3.712)

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