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標記定量蛋白質組iTRAQ&TMT

產品介紹

    標記定量蛋白質組iTRAQ&TMT

    標記定量蛋白質組iTRAQ&TMT介紹

    研究不同生理和病理條件下細胞內蛋白質的含量和狀態變化是比較蛋白質組學的核心內容。iTRAQ(isobaric tags for r elative and absolute quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)分別是由美國AB Sciex公司和Thermo公司研發的多肽體外標記定量技術,是目前運用最廣泛的兩種標記定量蛋白質組技術,分別通過與氨基酸末端氨基以及賴氨酸殘基的游離氨基結合,實現對多肽的標記,并通過不同分子量的試劑對不同來源樣品進行標記的方式實現不同樣品間蛋白質組比較的目標。


    青島歐易母公司-上海歐易特色

    ● 定量準確:可以檢測最少5%的差異

    ● 重復性好:組間重復性可達90%以上

    ● 數據豐富:一次實驗可得到上千個蛋白的定性和定量信息

    ● 通量高:iTRAQ可同時標記8個不同樣品,TMT最多可標記10個樣品


    標記定量蛋白質組iTRAQ&TMT技術路線

    iTRAQ技術路線-歐易生物
    TMT技術路線-歐易生物
    iTRAQ技術路線
    TMT技術路線


    標記定量蛋白質組iTRAQ&TMT原理介紹


    iTRAQ與TMT試劑均由報告基團、中性平衡基團和反應基團三部分組成。不同報告基團及其相對應平衡基團的質量和都相同,而反應基團能與賴氨酸ε-氨基和所有肽鏈的氨基末端連接,可標記所有氨基酸。不同標記試劑與來源于不同樣品胰酶消化后的肽段結合,經過色譜分離,并通過一級質譜和二級質譜分析。平衡基團在二級質譜時發生中性丟失,而報告基團在二級質譜低質量區域產生多個報告離子,其信號強度分別代表該標記樣品的表達量,根據報告離子的峰面積計算同一蛋白質同一肽段在不同樣品間的比值,從而實現蛋白的相對和絕對定量。


    標記定量蛋白質組iTRAQ&TMT項目流程



    標記定量蛋白質組iTRAQ&TMT項目流程-歐易生物


    標記定量蛋白質組iTRAQ&TMT質譜平臺


    ● TripleTOF 5600

    ● Q-Exactive


    數據分析內容


    ● 數據質控(歸一化、聚類分析、相關性分析、主成分分析)

    ● 蛋白質譜搜庫檢索 ● 差異表達蛋白質篩選

    ● 常規生物信息學分析(GO富集分析、KEGG通路分析、PPI分析)


    標記定量蛋白質組iTRAQ&TMT樣品要求


    ● 蛋白提取物:濃度>1 μg /μL,蛋白質總量>500 μg

    ● 細胞:5×10^6個

    ● 微生物:500 mg

    ● 組織樣品(濕重):植物200 mg,動物100 mg

    ● 血清和血漿等體液:200 μL


    常見問題


    ● 1.沒有全基因組數據的物種該如何進行蛋白的鑒定?
    對于已經公布全基因組序列的物種,可以在得到全序列后構建本地建庫并進行本地檢索;對于未進行全基因組測序的物種,可以采用近緣物種的數據庫或者EST數據以及轉錄組數據進行檢索。


    ● 2.iTRAQ及TMT等標記定量蛋白質組技術有什么特點?
    iTRAQ以及TMT等標記定量蛋白質組技術分辨率高,細胞樣品最多可鑒定超過6000個蛋白,并且絕大多數蛋白都有定量和定性信息;其次是通量高,可以一次最多完成8個(iTRAQ)或者10個(TMT)樣品的實驗,特別適合于多組樣品間的同時比較以及生物學過程的動態檢測。


    ● 3.iTRAQ及TMT實驗中增加混合樣本組的優勢是什么?
    由于混合樣本是所有樣品的等量混合,它包括所有樣品的蛋白信息,其性質介于所有樣品之間??梢砸暺錇榛鶞?,其他樣品和混合樣之間的相對定量就可以視為某個蛋白樣品的表達量,有利于直接查看蛋白在不同樣品之間表達量的趨勢變化和方便后續分析。


    ● 4.組學數據后續一般如何進行生物信息學分析?
    主要的分析包括基于統計的主成分分析、聚類分析、表達模式挖掘等,另外還包括基于生物學意義的GO功能分析,COG功能分析、Pathway代謝通路富集、蛋白互作、轉錄因子預測、代謝物功能回溯、相關模型和網絡構建等深入分析。


    案例展示


    案例一:假乳頭狀腫瘤蛋白組分析揭示內質網加工功能障礙

    研究背景:

    假乳頭狀腫瘤(SPTP)是一種少見的具有低度惡性潛能的實體性腫瘤,臨床上發病率低且術前診斷較為困難,存在較多的誤診與誤治。以往的研究常關注SPTP的臨床特征及生物標志物的搜尋,然而SPTP發生的潛在分子機制研究鮮有報道。


    研究內容:

    本文分別搜集了5例SPTP病人的癌與癌旁組織。作者將5組癌組織混合后分成3等分,同樣的,將5組癌旁組織混合后也分成3等分,并設置了癌組織與癌旁組織的混合樣作為內標組,最后得到7組樣品進行蛋白提取及iTRAQ標記。通過LC-MS/MS分析,作者在癌與癌旁樣品間一共鑒定到1171個差異表達蛋白質(>1.5倍,P≤0.05)。進一步對差異表達蛋白質進行GO富集分析和KEGG分析,發現內質網應激通路可能在SPTP成瘤過程中起重要作用,作者選取該通路中鑒定到的7個蛋白進行IHC驗證,IHC結果與iTRAQ定量結果一致。

    GO富集分析、KEGG分析及IHC檢測顯示內質網加工功能障礙是SPTP重要致病因素-歐易生物

    GO富集分析、KEGG分析及IHC檢測顯示內質網加工功能障礙是SPTP重要致病因素

    研究結果:

    從蛋白組水平進一步證實細胞粘附是SPTP重要致病因素之一,發現了核糖體、內質網、補體和凝血級聯反應等多個生物學過程與假乳瘤的關系,并對重點關注的內質網加工功能障礙對SPTP的影響做了深入分析。


    參考文獻:

    Zhu Y, Xu H, Chen H, et al. Proteomic analysis of solid pseudop apillary t umor of t he pancreas reveals dysfunction of the endoplasmic r eticulum protein processing pathway. Molecular & Cellular Proteomics. 13:2593-2603(2014). (IF: 7.254)


    案例二:環境溫度升高對微生物群落的影響

    研究背景:

    全球溫度升高會對微生物群落造成影響,進而直接影響全球生態系統??茖W家們在溫度對微生物群落的群落結構和特定的代謝過程做了許多研究,而較少使用組學手段對整個群落的反應做出全面的評估。


    研究內容:

    本文首次將TMT標記定量蛋白質組學技術應用在微生物群落研究上,精確地和可重復地在40℃、43℃和46℃三個溫度條件下定量到上千個微生物蛋白質。作者發現,溫度升高會引起單個微生物和整個群落的氨基酸代謝相關蛋白質上調,并抑制兩類螺菌屬微生物的固碳蛋白表達,然而在高溫下第三類螺菌屬微生物固碳蛋白則顯著上調。

    生物群落蛋白豐度變化分析-歐易生物

    生物群落蛋白豐度變化分析

    研究結果:

    定量蛋白質組學技術可以用于群落微生物研究,能鑒定到與代謝、生長、信號與壓力反應等過程相關的上千個差異表達蛋白,并能在生態群落中對單個微生物組實現定量蛋白質組學研究。


    參考文獻:

    Mosier A C, Li Z, Thomas B C, et al. Elevated t emperature alt ers proteomic responses of ind ividual organisms within a bio film community. The ISME journal. 9:180-194 (2015). (IF: 9.328)

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